Medicina molecular y genética

Typical reverse genetics systems for generating influenza viruses require the insertion of each genome segments by DNA ligation into vectors for genome synthesis and expression. Herein is described the construction and use of a novel pair of plasmid vectors for cloning all eight genome segments of influenza A virus by homologous recombination for influenza virus reverse genetics. Plasmids, pLLBA and pLLBG, were constructed to possess opposing RNA polymerase I and RNA polymerase II transcription units for generating influenza genomic and messenger RNAs, respectively. In addition these promoters flanked a recombination cassette which comprised the conserved 5’ (13bp) and 3’ (12bp) terminal promoters of influenza virus. These vectors differed due to the presence of an A or a G (plus sense) to correspond to differences at nucleotide position 4 among negative-sense influenza virus promoters. The cloning approach involved homologous recombination of each influenza gene segment and the appropriate linearized pLLBA or pLLBG vectors in E. coli. Direct cloning by recombination was simpler and faster than conventional restriction digestion and ligation methods. This new vector system was successfully used to clone and rescue various influenza viruses and thus has the potential to promote the rapid analysis and vaccine development of novel influenza strains.

With antigenically novel epidemic and pandemic influenza strains persistently on the horizon it is of fundamental importance that we understand whether heterosubtypic antibodies gained from exposures to circulating human influenzas exist and can protect against emerging novel strains. Our studies of IVIG obtained from an infection-naive population (Australian) enabled us to reveal heterosubtypic influenza antibodies that cross react with H5N1. We now expand those findings for an Australian donor population to include IVIG formulations from a variety of northern hemisphere populations. Examination of IVIGs from European and South East-Asian (Malaysian) blood donor populations further reveal heterosubtypic antibodies to H5N1 in humans from different global regions. Importantly these protect against highly pathogenic avian H5N1 infection in vitro, albeit at low titres of inhibition. Although there were qualitative and quantitative differences in binding and protection between globally different formulations, the heterosubtypic antibody activities for the respective IVIGs were in general quite similar. Of particular note because of the relative geographic proximity to the epicentre of H5N1 and the majority of human infections, was the similarity in the antibody binding responses between IVIGs from the Malayan peninsula, Europe and Australia. These findings highlight the value of employing IVIGs for the study of herd immunity, and particularly heterosubtypic antibody responses to viral antigens such as those conserved between circulating human influenzas and emerging influenza strains such as H5N1. They also open a window into a somewhat ill defined arena of antibody immunity, namely heterosubtypic immunity.

El objetivo de este estudio fue evaluar la varianza genética de las cepas de la enfermedad de Derzy (GPV) aisladas de casos ocurridos en Polonia. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predichas de las proteínas de superficie VP2 y VP3 de las cepas de GPV polacas se compararon con otras cepas previamente aisladas en Hungría, Francia, Alemania, China y Taiwán. La varianza genética observada de la secuencia de aminoácidos dentro del grupo de cepas polacas fue baja y alcanzó el 5% de la secuencia total analizada. Se encontraron diferencias considerables en la secuencia de aminoácidos en el caso de las cepas de GPV de campo polacas y la cepa MDPV FM del parvovirus del pato de Moscovia que también se analizó en este estudio. Las investigaciones realizadas confirmaron la presuposición de que las cepas de GPV polacas y las cepas previamente aisladas en Hungría y Francia comparten un origen común.

Se conocen bien las respuestas adaptativas y dramáticas de anticuerpos neutralizantes homosubtípicos a sitios inmunodominantes hipervariables de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) de cepas de influenza individuales. Estas definen los subtipos de influenza y las vacunas modeladas sobre sus antígenos HA y NA brindan protección estacional de anticuerpos neutralizantes contra la exposición posterior a la cepa y sus parientes cercanos, pero brindan poca o ninguna protección contra cepas que se desplazan o modifican antigénicamente. En contraste con esto, existe una forma diferente de respuesta de anticuerpos adquirida, llamada inmunidad heterosubtípica. Esta proporciona una respuesta de anticuerpos adaptativa más experimentada a epítopos inmunorrecesivos que están altamente conservados entre cepas. Si bien estas respuestas son de amplitudes individuales menores que los mecanismos estacionales, son activas en todos los subtipos de influenza y pueden brindar protección preventiva contra nuevas cepas que aún no han surgido. Las inmunidades heterosubtípicas se han estudiado bien en animales, pero sorprendentemente hay evidencia mínima de este tipo de inmunidad de anticuerpos en humanos. Por lo tanto, se defiende la noción de que las respuestas humorales estacionales pueden, a través de la exposición repetida a sitios ampliamente conservados en diferentes cepas, proporcionar a los humanos, en forma acumulativa, un nivel de protección amplio contra nuevas cepas emergentes, como el H5N1, que no brindan las respuestas humorales estacionales.

La vacunación de las aves de corral contra la gripe aviar se viene utilizando a gran escala en el sudeste asiático desde 2003 y en Egipto desde 2006 para luchar contra las epidemias de gripe aviar altamente patógena (HPAI) H5N1. La decisión de utilizar la vacunación masiva contra la HPAI en Egipto se tomó como una medida de emergencia basada en el impacto positivo de esas medidas de control en Vietnam y la República Popular China. Sin embargo, tres años después, el impacto en el control de enfermedades de la vacunación contra la IA en Egipto ha sido muy limitado. A pesar de la vacunación continua de las aves de corral contra la HPAI, se notifican regularmente brotes en aves de corral y casos humanos. Un estudio de evaluación reciente destacó importantes deficiencias en el actual programa de inmunización y su falta de impacto positivo en la propagación de la infección o el mantenimiento de la seguridad de la salud pública. Las deficiencias de la estrategia de vacunación pueden atribuirse en parte a la falta de apoyo suficiente en términos de financiación y comunicación, la ausencia de un sistema de seguimiento eficiente y la formación inadecuada de los técnicos de campo. Las dificultades de la vacunación generalizada en las granjas semicomerciales y en los sectores de las aves de corral domésticas son bien conocidas, pero es posible lograr mejoras en el sector industrial mediante mejores controles gubernamentales y una mayor colaboración con el sector privado. La vacunación contra la influenza aviar debe considerarse como una herramienta de control más dentro de un programa más amplio de control de enfermedades que integre la vigilancia, la investigación de brotes, los sistemas de gestión de enfermedades y la aplicación rigurosa de medidas de bioseguridad. Si se aplica incorrectamente, la vacunación contra la influenza aviar tiene un impacto limitado como medida de control de enfermedades. Además, si no se toman precauciones estrictas de bioseguridad durante su aplicación, las visitas a las granjas para vacunar a las aves de corral podrían facilitar la propagación del virus y, por lo tanto, convertirse en un factor de riesgo con importantes implicaciones para el mantenimiento del virus y el posible riesgo de exposición humana.

The virus which was responsible for the first benign wave of the Spanish Influenza in the spring of 1918, and which was to become extremely virulent by the end of the summer of 1918, was inextricably associated with the soldiers who fought during the First World War. The millions of young men who occupied the military camps and trenches were the substrate on which the influenza virus developed and expanded. Many factors contributed to it, such as: the mixing on French soil of soldiers and workers from the five continents, the very poor quality of life of the soldiers, agglomeration, stress, fear, war gasses used for the first time in history in a massive and indiscriminate manner, life exposed to the elements, cold weather, humidity and contact with birds, pigs and other animals, both wild and domestic. Today, this combination of circumstances is not present and so it seems unlikely that new pandemics, such as those associated with the avian influenza or swine influenza, will emerge with the virulence which characterized the Spanish Influenza during the autumn of 1918.