Medicina molecular y genética

El virus de la influenza A (IAV) es uno de los patógenos infecciosos más comunes en humanos y causa una morbilidad y mortalidad considerables. La reciente propagación de virus de influenza aviar H5N1 altamente patógenos ha reforzado la importancia de la preparación para pandemias. En la patogénesis de la infección por IAV, las proteasas celulares desempeñan papeles críticos en el proceso de entrada viral en las células que posteriormente conduce a daño tisular en los órganos infectados. Dado que no hay proteasa de procesamiento para el precursor de hemaglutinina (HA0) de la glicoproteína de fusión de membrana viral en IAV, la entrada del virus en las células está determinada principalmente por las proteasas de procesamiento HA0 celulares del huésped que activan proteolíticamente la actividad de fusión de membrana. HA0 del IAV humano estacional tiene el motivo de sitio de escisión de consenso Q(E)-T/XR y es procesado selectivamente por al menos siete proteasas de procesamiento de tipo tripsina diferentes identificadas hasta la fecha en experimentos con modelos animales utilizando IAV adaptado a ratón o sistema de expresión génica en células MDCK. Al igual que en el caso del virus de la influenza aviar altamente patógena (HPAI) A, el procesamiento endoproteolítico de la HA0 se produce a través de proteasas de procesamiento celular ubicuas, que reconocen selectivamente los motivos de sitios de escisión de consenso multibásicos, como RXK/RR y KXK/RR. Se ha informado que las enzimas de escisión para el motivo RXK/RR, pero no para el motivo KXK/RR, son furina y proproteína convertasa (PC)5/6 en la red trans-Golgi. Aquí informamos sobre nuevos miembros de las serina proteasas transmembrana de tipo II de la membrana celular, la serina proteasa en mosaico de forma grande (MSPL) y su variante de empalme TMPRSS13, que reconocen y escinden los motivos RXK/RR y KXK/RR sin calcio. Además, la infección por IAV regula significativamente al alza una tripsina pancreática ectópica latente, una de las potentes proteasas de procesamiento de HA, y pro-metaloproteasa de matriz-9, en varios órganos. Estas proteasas pueden dañar sinérgicamente la barrera hematoencefálica en el cerebro y la membrana basal de los vasos sanguíneos en varios órganos, lo que provoca edema grave y fallo multiorgánico. En esta revisión, analizamos estas proteasas como nuevas moléculas diana farmacológicas para el tratamiento del virus de la influenza aviar que actúan inhibiendo la multiplicación del virus de la influenza aviar y previniendo el fallo multiorgánico, además de los agentes antivirales, los inhibidores de la neuraminidasa viral.

Influenza A viruses are highly infectious respiratory pathogens that can infect many species. Birds are the reservoir for all known influenza A subtypes; and novel influenza viruses can emerge from birds and infect mammalian species including humans. Because swine are susceptible to infection with both avian and human influenza viruses, novel reassortant influenza viruses can be generated in this mammalian species by reassortment of influenza viral segments leading to the “mixing vessel” theory. There is no direct evidence that the reassortment events culminating in the 1918, 1957 or 1968 pandemic influenza viruses originated from pigs. Genetic reassortment among avian, human and/or swine influenza virus gene segments has occurred in pigs and some novel reassortant swine viruses have been transmitted to humans. Notably, novel reassortant H2N3 influenza viruses isolated from the US pigs, most likely infected with avian influenza viruses through surface water collected in ponds for cleaning barns and watering animals, had a similar genetic make-up to early isolates (1957) of the H2N2 human pandemic. These novel H2N3 swine viruses were able to cause disease in swine and mice and were infectious and highly transmissible in swine and ferrets without prior adaptation. The preceding example shows that pigs could transmit novel viruses from an avian reservoir to other mammalian species. Importantly, H2 viruses pose a substantial risk to humans because they have been absent from mammalian species since 1968 and people born after 1968 have little preexisting immunity to the H2 subtype. It is difficult to predict which virus will cause the next human pandemic and when that pandemic might begin. Importantly, the establishment and spread of a reassorted mammalian-adapted virus from pigs to humans could happen anywhere in the world. Therefore, both human and veterinary research needs to give more attention to potential cross-species transmission capacity of influenza A viruses.

Durante la última década, el virus de influenza aviar de baja patogenicidad (LPAI) H9N2 ha causado pérdidas económicas considerables debido a la disminución de la producción, el aumento de la mortalidad y el costo de la vacunación en la industria avícola iraní. Debido a la amplia incidencia de esta enfermedad y al potencial del virus para mutar a una forma altamente patógena (HP) y transmitirse a los humanos, es imperativo comprender la patogénesis y las propiedades de estos virus. En este estudio, se realizó un ensayo de PCR en tiempo real TaqMan de dos pasos para la cuantificación del virus A/chicken/Iran/772/1998(H9N2) en varios órganos de pollos de engorde en diferentes días posteriores a la inoculación (DPI). Se inocularon cuarenta pollos de engorde comerciales de 5 semanas de edad con el virus. Se seleccionaron cinco pollos al azar los días 1, 3, 6 y 9 PI. Se recogieron muestras de tráquea, pulmones, bazo, riñones, páncreas, sangre y heces para la detección del virus. Se realizó una prueba de PCR y las muestras positivas se utilizaron para el ensayo cuantitativo de PCR en tiempo real. El resultado del ensayo RT-PCR mostró la presencia del virus en la tráquea (40%, 33%), pulmones (20%, 66,6%) y bazo (20%, 50%) de los pollos infectados los días 3 y 6 PI, respectivamente. El virus también se detectó en los riñones de los pollos inoculados los días 3 (40%), 6 (60%) y 9 (100%) DPI. En las muestras fecales, el virus solo se detectó el día 6 PI (83,3%). La cuantificación molecular del virus de la influenza aviar mostró que el título del virus de la influenza aviar en la tráquea, los pulmones y el bazo de los pollos a los 3 DPI es menor que el título del virus de la influenza aviar a los 6 DPI en estos órganos. El título más alto se observó en las heces. El título del virus de la influenza aviar en todos los órganos de las aves que murieron a los 6 DPI fue mayor que el de los mismos órganos en las otras aves experimentales.

Los virus de la gripe aviar se consideran contribuyentes clave a la aparición de pandemias de gripe humana. Un determinante principal de la infección es la presencia de receptores virales en células susceptibles a las que la hemaglutinina viral es capaz de unirse. Los virus aviares se unen preferentemente a receptores ligados al ácido siálico E2,3-galactosa (SAE2,3-Gal), mientras que las cepas humanas se unen a receptores ligados al ácido siálico E2,6-galactosa (SAE2,6-Gal). Si bien los patos son el principal reservorio de los virus de la gripe, suelen ser resistentes a los efectos de la infección viral, en contraste con la enfermedad frecuentemente grave observada en los pollos. Para comprender si las diferencias en los receptores podrían contribuir a esta observación, estudiamos la distribución de los receptores de la gripe en órganos de patos y pollos utilizando histoquímica de lectinas con lectinas específicas de ligamiento y ensayos de unión al receptor con virus de la gripe porcina y aviar. Aunque las células epiteliales intestinales de ambas especies expresaron únicamente receptores SAE2,3-Gal, encontramos una presencia generalizada de receptores SAE2,6-Gal y SAE2,3-Gal en muchos órganos de pollos y patos. La coexpresión de ambos receptores puede permitir la infección de células con virus tanto aviares como humanos y, por lo tanto, presentar una ruta para la redistribución genética. Hubo una marcada diferencia en el tipo de receptor primario en la tráquea de pollos y patos. En la tráquea de pollo, SAE2,6-Gal fue el tipo de receptor dominante, mientras que en los patos los receptores SAE2,3-Gal fueron los más abundantes. Esto sugiere que los pollos podrían ser más importantes como hospedadores intermediarios para la generación de virus de influenza con una mayor capacidad para unirse a los receptores SAE2,6-Gal y, por lo tanto, un mayor potencial para la infección de humanos. Las células epiteliales traqueales e intestinales del pollo también expresaron una gama más amplia de receptores SAE2,3-Gal (subtipos G(1-4)GlcNAc y G(1-3)GalNAc) en contraste con los patos, lo que sugiere que pueden ser capaces de soportar la infección con una gama más amplia de virus de influenza aviar.

Las mutaciones en el dominio HA1 de la hemaglutinina viral de la influenza aviar A pueden alterar la especificidad de unión de la HA para los receptores de sialósidos F, cambiando el rango de hospedadores del virus de las aves a los humanos. Las mutaciones de aminoácidos pueden ocurrir en el sitio de unión del sialósido, así como en el sitio antigénico, lejos del sitio de unión. Por lo tanto, un estudio teórico que implique la predicción in silico de la unión de HA-sialosacárido puede requerir un análisis químico cuántico del dominio completo de HA1 complejado con sialósidos, equilibrando un costo computacional con el tamaño del modelo del complejo HA1-sialósido. Además, no hay información sobre la relación entre el tamaño del modelo del complejo HA1-sialósido y su energía de unión. En este estudio, se investigaron los dominios completos del subtipo H3 HA1 en complejos con análogos del receptor Neu5AcF(2-3 y 2-6)Gal de tipo aviar y humano mediante el método de orbital molecular de fragmentos (FMO) basado en ab initio a nivel de perturbación de Møller-Plesset de segundo orden (MP2)/6- 31G. Utilizando este enfoque, descubrimos que el subtipo H3 HA1 aviar se une al receptor F2-3 aviar con mayor fuerza que al receptor F2-6 humano en fase gaseosa, por un valor de 15,3-16,5 kcal/mol. Este beneficio de unión fue mayor que en el complejo modelo pequeño. El análisis de las energías de interacción entre fragmentos (IFIE) entre el receptor Neu5Ac-Gal y los residuos de aminoácidos en el dominio completo del subtipo H3 HA1 también confirmó la mayor especificidad de unión del subtipo H3 aviar-F2-3 aviar. Fue particularmente importante evaluar las IFIE de los residuos de aminoácidos en un radio de 13 Å alrededor de Neu5Ac-Gal para tener en cuenta las interacciones electrostáticas de largo alcance en el modelo de complejo HA1-sialósido más grande. Estos resultados sugieren que el tamaño adecuado del complejo HA1-sialósido es significativo para estimar la energía de enlace HA1-sialósido y el análisis de IFIE con el método FMO.

Almost all influenza virus proteins are found to contain caspase cleavage motifs. Two caspase cleavage consensus sequences, EXDBY and D/EXXDBY (caspase motifs) were identified in N- and C-terminal regions of influenza virus proteins nucleocapsid NP (positions D16 and D497) and ionic channel M2 (positions D23 and D87). Using reverse genetics with the highly-virulent avian influenza virus A/FPV/Rostock (H7N1), as a vector precursor, these NP and M2 caspase motifs were artificially altered by site-directed mutagenesis and pathogenicity of the generated caspase mutant viruses was tested in chickens. Three main groups of virus mutants were identified. The first group of mutants was characterized by high replication in cells and low virulence in chickens. These virus mutants possessed the altered N-terminal NP and C-terminal M2 caspase motifs. The second group of virus mutants, possessing the altered N-terminal caspase motif of M2, was characterized by attenuated replication in cultured cells and reduced pathogenic properties in chickens. Third, mutations generated in the C-terminus of NP were lethal and restricted virus rescue by reverse genetics, implying a critical role of this caspase site in virus replication. Thus, these data suggested that, (i) caspase motifs in virus proteins play a significant role in virus pathogenicity; (ii) the lack of direct correlation between replication potential and pathogenicity, observed in caspase mutants of the first virus group, implied that virus caspase motifs could affect immunopathogenesis during the infection process, rather than simply controlling virus production in target cells in the chicken host.