Medicina molecular y genética

Análisis cuantitativo de la expresión de ARN asociado a virus tras la transducción con un vector de adenovirus incompetente para la replicación in vitro e in vivo

Abstract

Keisaku Wakabayashi, Mitsuhiro Machitani, Kahori Shimizu, Masashi Tachibana, Fuminori Sakurai y Hiroyuki Mizuguchi

El genoma del adenovirus (Ad) codifica uno o dos ARN pequeños no codificantes llamados ARN asociados al virus (VA), que son transcritos por la polimerasa III y apoyan la replicación del Ad. Como se informó anteriormente, un vector Ad incompetente para la replicación, que se usa ampliamente no solo en estudios de terapia génica, incluidos ensayos clínicos, sino también en investigaciones básicas como vehículo de administración de genes, así como el Ad de tipo salvaje (WT-Ad) expresan VA-RNA, y los VA-RNA activan la inmunidad innata, incluida la producción de interferones de tipo I. Además, los VA-RNA perturban los perfiles de expresión de microRNA (miRNA) celular a través de la inhibición competitiva de componentes clave involucrados en la vía de maduración de miRNA. Aunque estas características de los VA-RNA podrían afectar negativamente la aplicación de vectores Ad, los perfiles de expresión de VA-RNA luego de la transducción con un vector Ad no se han examinado por completo. En este estudio, analizamos cuantitativamente los perfiles de expresión de VA-RNAI, que es una especie importante de VA-RNA, después de la transducción con vectores Ad in vitro e in vivo utilizando RT-PCR en tiempo real. Los niveles de expresión de VA-RNAI en las células transducidas con un vector Ad convencional que expresa luciferasa (Ad-CAL2) a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 fueron aproximadamente de 2000 a 3000 veces más bajos que los infectados con WT-Ad a la misma MOI a las 48 h después del tratamiento. Los niveles de expresión de VA-RNAI en el hígado del ratón después de la administración con Ad-CAL2 fueron aproximadamente 600 veces más bajos que los de la administración con WT-Ad a las 48 h posteriores a la administración. La supresión mediada por miRNA de la expresión permeable de los genes E4 de Ad resultó en una reducción de aproximadamente cinco veces en el número de copias de VA-RNAI en el hígado después de la administración sistémica en ratones. Estos datos proporcionan pistas informativas para el desarrollo de nuevos vectores Ad más seguros.