Revista de genética e investigación del ADN.

Generación de terapias de acción prolongada utilizando enlaces glicosilados

Abstract

Abdulrahman Alshehri,

Fundamento: Los fármacos terapéuticos actuales, como la hormona del crecimiento (GH), el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF) y la leptina, requieren inyecciones diarias, que son incómodas y caras. Por lo tanto, se han probado varios enfoques para reducir la depuración de los regímenes terapéuticos, principalmente mediante la conjugación con otra fracción. Una de esas tecnologías que ya se está empleando es la pegilación; sin embargo, se ha demostrado que no es biodegradable y es tóxica. Un estudio previo de Asterion ha demostrado que el uso de enlaces glicosilados entre dos ligandos de GH para crear tándems de proteínas dio como resultado su glicosilación y un aumento del peso molecular (PM) manteniendo la actividad biológica. Se presentará el uso de esta tecnología utilizando GCSF como ejemplo, pero se puede aplicar fácilmente a otras moléculas como la leptina. Hipótesis: La incorporación de enlaces glicosilados variables entre dos ligandos de GCSF creará una construcción con un peso molecular alto y protegida de la proteólisis, lo que dará como resultado una depuración reducida sin bloquear la bioactividad. Metodología: Se clonaron y secuenciaron tándems de GCSF con enlaces que contenían entre 2 y 8 motivos de glicosilación NAT y sus respectivos controles (Q reemplaza a N en el motivo de secuencia NAT, por lo que no hay glicosilación). Luego de la expresión en células de ovario de hámster chino (CHO), la proteína expresada se analizó mediante SDS PAGE para confirmar los pesos moleculares. Se probó la bioactividad in vitro utilizando un ensayo de proliferación AMLâ? 193. Se utilizó cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) para purificar la proteína. Las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de las proteínas tándem de GCSF purificadas se midieron en ratas Sprague Dawley normales con plena aprobación ética. Resultados: Los tándems glicosilados purificados muestran un mayor peso molecular que el de los controles cuando se analizan mediante SDS PAGE. Todos los tándems de GCSF muestran una mayor bioactividad en comparación con el GCSF nativo. Tras la administración intravenosa a ratas, GCSF2NAT, GCSF4NAT, GCSF8NAT que contienen 2, 4 y 8 sitios de glicosilación respectivamente y GCSF8QAT (control en tándem de GCSF no glicosilado) mostraron una vida media circulante aproximadamente 3 veces más larga en comparación con la informada para el GCSF nativo (1,79 horas). Tanto GCSF2NAT como GCSF4NAT muestran un aumento significativo en el porcentaje de neutrófilos sobre los controles a las 12 horas posteriores a la inyección. Sin embargo, este efecto es de corta duración ya que los recuentos a las 24 horas o más no son significativamente diferentes a los controles. GCSF8NAT muestra un aumento en el porcentaje de neutrófilos que solo es significativo a las 48 horas. Conclusión: Los resultados muestran que el uso de enlaces glicosilados para generar tándems de GCSF da como resultado moléculas con mayor peso molecular, bioactividad in vitro mejorada, vidas medias circulantes más largas y una población de neutrófilos mejorada en comparación con el GCSF nativo y el no glicosilado. proteína tándem glicosilada